Spa-typing
Spa- typing er basert på analyse av deler av ett gen som ligger i x-regionen på Staphylococcus protein A genet (spa). 3’-enden av genet har en repetisjonsregion som består av et variabelt antall av vanligvis 24 bp repetisjoner med interne nukleotideforskjeller i hver repetisjon.
Denne x- regionen av spa utsettes for spontane mutasjoner, tap av repetisjoner, og opptak av repetisjoner.
Den sekvensbaserte metoden av spa-typing tildeler repetisjonen en numerisk kode som er unik for hver nukleotidekombinasjon, og spa-typen blir bestemt av rekkefølgen av spesifikke repetisjoner.
Spasekvensen blir automatisk tildelt en spa-type ved synkronisering med RIDOM StaphType database 4. Sekvensdata er levert av SeqNet.org.
Eksempel:
Spa-type t002
Figur 4. Excel analyse
Slektskapet mellom forskjellige spa-typer kan analyseres bl.a. ved hjelp av BURP analyser (Figur 3) eller regneark der man sorterer på repetisjoner (Figur 4). Spa-typer og repetisjoner kan lastes ned via nettsidene til RIDOM, www.ridom.de/spaserver/
MLST – Multi Locus Sequence Typing
MLST er basert på sammenligning av DNA sekvenser fra konserverte “husholdnings” gener som er karakterisert med lavt seleksjonspress.
For S. aureus analyseres 7 genfragmenter der hver av dem er ca 450- 500 bp. Den spesifikke DNA sekvens for hvert gen i en stamme blir gitt et allelenummer ved innsending til en universal database (http://saureus.mlst.net/).
Sekvenstypen av en S. aureus stamme er basert på kombinasjonen av allelenummer på hver av de 7 genene.
Eksempel:
Ved hjelp av eBURSTanalyse kan forskjellige stammer bli gruppert i klonale kompleks (CC) av nært beslektede stammer som har minst fem eller seks alleler felles.
Opprinnelsen for hver CC er den genotypen med flest singel eller dobbel locus varianter (Figur 5).
MLST skiller bare de store klonale slektene og dens diskriminerende evne er ikke god nok for separasjon av stammer i en klonal gruppe når hensikten er å undersøke lokale utbrudd. Likevel er metoden nyttig i beskrivelsen av den evolusjonelle historien til MRSA, men er arbeidskrevende og kostbar.
Figur 5. eBURST analyse
PFGE – Pulsfelt gelelektroforese
PFGE er fremdeles metoden som er ansett som gullstandard for molekylær epidemiologisk karakterisering av utbrudd over en kort tidsperiode og i begrensede geografiske områder. Diskrimineringsstyrken er utmerket, men metoden er arbeidskrevende, tar lang tid og er avhengig av bioingeniørens erfaring. Metoden er basert på tilfeldig distribusjon av restriksjons endonuklease kutteseter i genomet. Ved bruk av restriksjonsenzym kuttes genomet i fragmenter med forskjellig lengde. For S. aureus er enzymet SmaI godt egnet, da det gir et mønster av 8 – 20 fragmenter med størrelser fra 8 til 800 kb når det
blir analysert av pulsfelt gelelektroforese (Figur 1).
Figur 1. Separasjon av store restriksjonsfragmenter krever bruk av pulsfelt av elektrisk strøm fra 24 elektroder plassert i en heksagonal kontur som veksler retning over 120o fast vinkel og en forlenget elektroforesetid. Figuren er hentet fra CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System, Instruction Manual and Application Guide.
Stammene differensieres av antall og størrelse på fragmenter som et resultat av forskjellige genetiske hendelser som endrer endonuklease restriksjonssete. Enkle punktmutasjoner, insesjoner, delesjoner, inversjoner eller transposisjoner kan føre til tap eller vinning av et nytt restriksjonssete, som fører til 3 fragmenters forskjell mellom stammene.
Tolkningen av fragmentmønster mellom stammene kan gjøres manuelt, basert på objektive kriterier (Figur 2a), eller gjøres med standardisert dataanalyse (Figur 2b).
Figur 2. Bilde av PFGE som viser fragmentmønster av 3 forskjellige MRSA stammer (brønn 2-4) med standard i brønn 1 (a), og dendrogram som viser genotypisk innbyrdes slektskap mellom valgte MRSA stammer v.hj.a. databasert kluster analyser (b).
Stammer kan klassifiseres som like, nært beslektet, mulig beslektet eller ulike. Klassifiseringen ”nært beslektet” brukes om 1 - 3 fragments forskjell mellom stammene, som mest sannsynlig skyldes én genetisk hendelse. ”Mulig beslektet” brukes om 4 - 6 fragments forskjell, mens stammer som har mer enn 7 fragments forskjell blir regnet som ulike.
Kriteriene er nyttig i tolkningen av fragmentforskjeller, men bør brukes med forsiktighet, og bare når man sammenligner epidemiologisk beslektede bakteriestammer
Referanser
Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH, Swaminathan B. (1995) Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol Sep;33(9):2233-9.
Melles DC, van Leeuwen WB, Snijders SV, Horst-Kreft D, Peeters JK, Verbrugh HA, van Belkum A. (2007) Comparison of multilocus sequence typing (MLST), pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), and amplified fragment length polymorphism (AFLP) for genetic typing of Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods May;69(2):371-5. Epub 2007 Feb
Harmsen D., Claus H., Witte W., Rothgänger J., Claus H., Turnwald D., & Vogel U. (2003) Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting using a novel software for spa-repeat determination and database management. J. Clin. Microbiol 41:5442-8
Enright MC, Robinson DA, Randle G, Feil EJ, Grundmann H, Spratt BG. (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 7687-7692.